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技术背景

CAR-T细胞疗法作为一种癌症治疗手段的出现标志着医学新时代的开始,为对抗诸如癌症等复杂性疾病提供了变革性的手段。使用经工程学设计以识别B淋巴细胞肿瘤的T细胞临床试验显示,在急性和慢性白血病中具有高响应率(70%–90%)和持久性。2017年有两类批准上市的CAR-T细胞疗法。尽管这些技术手段带来了彻底改变癌症治疗的希望,但由于存在安全性和脱靶毒性以及耐药性,对CAR-T细胞治疗肿瘤的乐观情绪渐渐趋于理性。同时,针对细胞免疫治疗也在不断发掘对实体瘤临床疗效的突破。未来几年该领域在安全性、可靠性和针对实体瘤疗效方面的发展最终将决定这种新形式在对抗癌症中具有多大发展潜力。


服务概括

CAR-T细胞在进行临床试验前需要完成临床前研究,包含抗原的生产和scFv筛选,CAR病毒载体构建,T细胞转染,靶细胞表面抗原验证,CAR-T细胞体内外杀伤能力和增殖能力检测等。dafabe888手机版登录以“CAR-T用抗体药物研发”的临床转化为目标,可提供优质的抗体筛选,体外功能改造,多种形式的CAR组合,体外细胞检测和体内药效验证等服务,后期可为联合申请临床试验提供技术支持。



服务亮点
  • 靶点选择经验丰富
    1. 基于三大数据库(Tabs, Informa, Proteinatlas)的数据支撑,可以对靶点的特征、临床进展和竞品分析进行快速高效的分析。
  • 抗体选择库容第一
    1. 具有全球最大库容的全人源抗体库,能够最大可能的帮您筛选到靶点的理想抗体。
  • 候选分子极致优化
    1. 不同的建库、筛选策略,以及个性化功能改造(人源化、小型化、亲和力成熟、PTM去除),可对筛选到的候选分子进行极致的优化。
  • 构建改造成熟稳定
    1. dafabe888手机版登录的CAR质粒构建基于多种结构选择,可以满足二代、三代、四带CAR结构的病毒包装一站式服务。
  • 药效检测系统全面
    1. 除了灵敏度高、特异性强、重复性好的多内体内药效检测;还会通过异种移植模型模拟CAR-T在人体内的真实效果,与体外结果进行对比,可获得更精确CAR-T药效评估。

服务特性

CAR-T细胞在进行临床试验前需要完成临床前研究,包含抗原的生产和scFv筛选,CAR病毒载体构建,T细胞转染,靶细胞表面抗原验证,CAR-T细胞体内外杀伤能力和增殖能力检测等。dafabe888手机版登录以“CAR-T用抗体药物研发”的临床转化为目标,可提供优质的抗体筛选,体外功能改造,多种形式的CAR组合,体外细胞检测和体内药效验证等服务,后期可为联合申请临床试验提供技术支持。


1.靶点筛选

数据库靶点分析、初筛,三大数据库支撑(Tabs,Informa,Proteinatlas);

靶点调研:分析靶点的特征、临床进展和竞品信息。



2.抗体产生

基于大容量,人天然、半合成、纳米和小鼠免疫库产生抗体;
辅以固相、液相、细胞FACS筛选和成药性评价。


3.CAR设计及构建

不同功能结构的CAR设计;
个性化功能改造(人源化、小型化、亲和力成熟、PTM去除)。



4. CAR质粒构建和病毒包装

不同结构CAR质粒构建;

高滴度慢病毒包装产生。




5.体外成药检测

CAR-T对肿瘤细胞杀伤活性评价:LDH assay;
CAR-T激活试验:ELISA检测细胞因子;

CAR-T增殖活性检测: CFSE assay。




6.体内药效验证

CDX,PDX等多种成瘤模式;
移植瘤体积检测;
免疫组化检测肿瘤相关参数;
CAR细胞药代动力学检测: CFSE assay多时间点检测体内CAR细胞增殖情况;

安全性评价:小鼠长期生存状况改善评价;体内细胞因子释放多时间点检测。




案例展示
抗X2靶点纳米抗体的开发

X靶点是胃癌的潜力靶点:人胃癌发病率高、早诊率低、死亡率靠前;相关治疗药物的开发迫在眉睫。蛋白X是构成紧密连接结构的一种膜蛋白,具有四次跨膜结构;其两个剪切变体X1和X2的氨基酸序列一致性高达91%。70%的胃癌患者高表达X2,且预后较差;X2蛋白仅特异性表达于胃上皮细胞,有望开发胃癌特异抗体药物。 


临床进展:目前仅一款抗-X2抗体药物处于三期临床,其与紫衫醇联合用药的二期临床数据显 示,-X2过表达的胃食管癌病人用药后的总生存期从9个月提升到 16.7个月,多个抗体进入临床。 


dafabe888手机版登录通过羊驼免疫库筛选得到 anti-X2 sdAb (C2) ,后与IgG1 FC融合,得到一个体内外药效显著的候选分子。该嵌合抗体 不结合X1蛋白;能够激活ADCC和CDC效应,而且偶联后较好的的细胞毒性效应;动物模型实验证明该抗体能够抑制肿瘤生长; 体内外药效与对照抗体相当,甚至更优。


1.抗X2单抗作用机制 

抗X2单抗主要通过与肿瘤细胞表面的X2结合,刺激激活抗 体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC), 还可以诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖。

Fig. 1 Mechanisms of targeting X2 in cancer From 

http://www.imgt.org/IMGTeducation/IMGTlexique/


2.结合活性测定

Human X2-HEK293T:Fig. 1A 显示候选抗体与Human X2- HEK293T细胞的亲和力测定结果,其中C1的亲和力水平与对 照抗体相当,其余抗体的亲和力水平优于对照抗体。 


Human X2- KATOIII:Fig. 1B显示候选体与X2- KATOIII细胞的亲和力测定结果,包括C2在内的大部分候选抗体的亲和力水平接近对照抗体。


Fig. 1 Binding affinity determination by FACS


3.ADCC、CDC活性测定

候选抗体由于包含有IgG1 Fc片段,可以 ADCC和CDC效应对靶细胞进行杀伤。 


ADCC: 如 图 Fig. 3A所 示 , 候选抗体 C1、C2、C4对 Human X2-HEK293T 细胞的ADCC杀伤效果均与对照抗体相当。如图 Fig. 3B, 候选抗体C1、C2 和 C4对Human X2- KATOIII的ADCC杀伤效果均显著优于对照抗体。


CDC:如图 Fig. 4A 所示 , 候选抗体C1、C4对Human X2-HEK293T细胞的CDC杀伤效果优于对照抗体,C2的效果则与对照抗体相当。如图 Fig. 4B , 候选抗体C1、C2和C4对Human X2- KATOIII 的CDC杀伤效果均显著优于对照抗体。


Fig. 3 ADCC assay (A: Human X2-HEK293T; B: Human X2- KATOIII)

Fig. 4 CDC assay (A: Human X2-HEK293T; B: Human X2- KATOIII)


4.內吞活性测定 

毒素分子可以通过抗体介导的内吞作用进入细胞,抑制细胞生长。如图 Fig.5 所示,靶细胞经候选抗体(C1,C2,C4) 处理后,通过LDH法检测,发现 Human X2-HEK293T细胞生长均受到明显抑制,表明这三个候选抗体均具有良好的内吞活性。


Fig. 5 Internalization assay on Human X2-HEK293T cell


5.特异性、种属交叉活性测定 

抗原特异性测定: 使用Human X2-HEK293T和Human X1- HEK293T细胞株进行流式测定,如图 Fig. 6, 候选抗体和对照抗 体均能够特异性结合Human X2而不结合Human X1。 


人鼠交叉活性测定: 使用Human X2-HEK293T和Mouse X2- HEK293细胞株进行流式测定,如图 Fig. 6, 候选抗体和对照抗 体均可以同时识别Human X2和Mouse X2,具有人鼠种属交叉活性。

Fig. 6 Specificity and human-rat cross-reactivity assay


6.动物模型药效评价 

候选分子C2在SCID小鼠CDX模型的体内抗肿瘤药效验证结果如Fig. 7所示。小鼠分为对照组和治疗组,每周给药两次,连续给药三周。结果显示:候选抗体在与对照抗体等摩尔浓度剂量下,基本可以完全抑制肿瘤的生长。


Fig. 7 Tumor growth inhibition