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技术背景
治疗性蛋白药物相对于传统小分子药物,分子量大,结构非常复杂,多个位点存在潜在的翻译后修饰(PTM),必须对这些修饰进行鉴别和控制。同时这些蛋白质药物来自于活细胞,从各种生物基质中分离得到,即使单克隆产物也是由紧密相关的不同分子量和不同电荷的异构体组成的不均一混合物,且往往包含多种与产品和工艺相关的杂质,对于杂质,尤其是那些可能诱导发热反应或免疫反应的化合物必须进行鉴定、表征并尽可能减少其在最终产品中的含量。因此,全面的化学、物理和构象表征对于了解重组蛋白药物的异质性、杂质谱和有效性是非常必要的。

dafabe888手机版登录经过多年的技术沉淀和升级,已建立起单抗、多抗和融合蛋白的多维理化表征分析平台,累积分析分子数千个,涉及早期研发,小试工艺开发各个药物研发阶段,并按药典建立了完善的标准体系。通过准确并且可重复的表征方法对药物生产以及制剂决策提供支持和指导。

服务亮点
  • 分析表征全面多样
    1. dafabe888手机版登录多维理化表征分析平台拥有丰富的检测项目和检测手法,全面覆盖浓度、含量、纯度分析、翻译后修
      饰一级结构和高级结构、残留检测等各个维度。
  • 全面质量管理体系,数据合规可追溯
    1. 平台建立了全面、严格的质量管理体系,确保分析检测结果的合规性、真实性、可靠性和可追溯性。
  • 国际先进的仪器设备,分析准确、稳定
    1. 平台拥有国际先进的仪器设备和系统规范化的操作方法,操作人员经验丰富,确保表征分析结果准确高、稳定性好。
  • 团队经验丰富
    1. 团队经已完成数百个相关分析项目,能够快速完成表征分析的检测,交付准确度高、稳定性好的结果。

服务内容
服务名称 服务内容 客户提供 交付物及标准 周期
鼠源抗体人源化 1. 人源化设计
2. 基因合成
3. 载体构建
4. 真核表达
5. 质检分析
鼠源抗体序列、靶点蛋白及
对照抗体、鉴定用细胞株等
交付物:人源化序列、蛋白、
质粒及检测报告
4-6 周
驼源抗体人源化 1. 人源化设计
2. 基因合成
3. 载体构建
4. 真核表达
5. 质检分析
驼源抗体序列、靶点蛋白及
对照抗体、鉴定用细胞株等
交付标准:人源化比例>95%,
至少有一个抗体亲和力与母
本相似或者更好
4-6 周
兔源抗体人源化 1. 人源化设计
2. 基因合成
3. 载体构建
4. 真核表达
5. 质检分析
兔源抗体序列、靶点蛋白及
对照抗体、鉴定用细胞株等
交付标准:人源化比例>95%,
至少有一个抗体亲和力与母
本相似或者更好
4-6 周

附加服务
子服务1:浓度测定(Protein A-HPLC)

技术简介

Protein A 是金黄色葡萄球菌的免疫球蛋白-Fc (IgG)受体,对Fc有强亲和性,由于具有高选择性和高回收率,可以一步完成从复杂混合物中分离IgG或者Fc融合蛋白。在近中性缓冲液条件下,Protein A与抗体选择性结合,在细菌或者细胞上清液中的其他成分流出后,改变流动相条件至酸性将与Protein A 结合的抗体洗脱出来。


案例展示

如下图所示,通过ProteinA-HPLC法绘制对照抗体IgG1的标准曲线,峰型呈正态分布,峰面积与浓度线性R2为0.995,线性良好,为抗体蛋白浓度测定提供了快速的数据支持。



服务内容

检测内容 检测方法 客户提供 交付物及标准 周期
浓度测定  Protein A-HPLC
待测抗体、缓冲液
检测报告
2 天

注:供试品蛋白体积应不少于200 µL,预期浓度大于0.125 ug/ml。

子服务2:蛋白含量测定(UV280)

技术简介

本方法依据蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸,其在280 nm波长处具最大吸光度,在一定范围内其吸光度大小与蛋白浓度呈正比。


案例展示

如Table 1所示,通过商品化的BSA确认仪器的系统适用性,再将待测样品利妥昔单抗(Rituximab)稀释至紫外分光光度计的吸光度范围进行吸光度值测定(n=3)。最后通过浓度与吸光度,稀释倍数和消光系数间的关系(S = A280 × DF / ε )计算得到待测样品的浓度,为蛋白浓度测定提供了准确的数据支持。


Table1 待测样品的吸光度测定记录


服务内容

检测内容 检测方法 客户提供 交付物及标准 周期
蛋白含量测定  UV280
待测抗体、缓冲液
检测报告
2 天

注:此样品需是蛋白成分单一的经过纯化的样品。液体样品浓度需大于0.5 mg/mL,总量不低于0.5 mg。

子服务3:纯度鉴定
(SDS-PAGE, CE-SDS, SEC)

技术简介

SDS-PAGE, CE-SDS, SEC是抗体分子大小纯度检测的主要手段。SDS-PAGE是传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳,CE- SDS是近年来新兴的毛细管凝胶电泳,两者均在SDS 的存在下将蛋白分子去折叠, 检测变性条件下分子大小分布,对于抗体的碎片有着更高的分辨率。前者操作简单,成本低,后者分辨率和灵敏度高,是药典规范的QC放行检测项;SEC中采用的色谱固定相是多孔性填料,样品中的大分子不能进入孔洞而完全被排阻,首先从柱中被流动相洗脱出来;中等大小的分子能进入填料中一些适当的孔洞中,但不能进入更小的微孔,在柱中受到滞留,较慢地从色谱柱洗脱出来;小分子可进入填料中绝大部分孔洞,在柱中受到更强的滞留,会更慢的被洗脱出,从而实现具有不同分子大小样品的完全分离。相对CE-SDS对抗体碎片分离度更好,SEC则能更好地区分抗体的聚体和单体。三者互为补充,提供全面的蛋白纯度鉴定。应用场景广泛,从培养基优化、克隆筛选、配方稳定性研究和纯化过程监测,到蛋白表征、相关杂质检测、和蛋白质药物产品的质量控制。


应用方向

用于还原和非还原重组蛋白的纯度分析和表观分子量确定。
CE-SDS方法定量更加准确,在还原模式中还可对抗体药物的非糖基化重链进行分离和准确定量。
重组蛋白聚集体及降解产物分析。


案例展示

1. SDS-PAGE

如Fig. 2所示, SDS-PAGE能够准确确定分子量大小及主条带纯度,达到纯度分析的目的。


Fig. 2 SDS-PAGE


2. CE-SDS

如Fig. 3,Fig. 4所示,CE-SDS能够准确定量分子大小分布及主峰纯度, 对抗体的碎片有着更高的分辨率,为抗体蛋白纯度鉴定提供更准确的数据支持。


Fig. 3 Non-reduced CE-SDS



Fig. 4 Reduced CE-SDS




3. SEC 

如下图所示,SEC可基于溶液中蛋白质的流体动力学尺寸进行分离,能准确分离出Sample1的聚体含量4.21%,单体含量95.79%,达到聚体分析的目的,为抗体蛋白纯度鉴定提供精准的数据支持。



服务内容

检测内容 检测方法 客户提供 交付物及标准 周期
蛋白大小异构体分析 SDS-PAGE 待测抗体、缓冲液 检测报告 1 天
蛋白大小异构体分析 CE-SDS 待测抗体、缓冲液 检测报告 2 天
蛋白大小异构体分析 SEC-HPLC 待测抗体、缓冲液 检测报告 2 天

注:

1.SDS-PAGE: 液体样品浓度需大于0.2 mg/mL,总量不低于5 μg。
2.CE-SDS: 液体样品浓度需大于1.0 mg/mL,总量不低于100 μg。
3.SEC: 液体样品浓度需大于0.5 mg/mL,总量不低于50 μg。

子服务4:电荷异质性分析(CEX)

技术简介

离子交换色谱法(IEC)的固定相,其表面上具有一种带电配合基,这种配合基能够与带有相反电荷的分析物相互作用。弱阳离子交换方法(CEX)中,带负电的表面配合基与带正电的分析物相互作用,然后可通过盐梯度或pH梯度实现对单克隆抗体电荷变异体的洗脱,酸峰早于主峰洗脱出来,而碱峰晚于主峰洗脱出来。电荷变量是测定抗体药物降解变异最灵敏的一种方法。


应用方向

常被用于测定单克隆抗体生产和纯化之后存在的酸性和碱性电荷异构体。
在生物类似药小试工艺开发前期克隆筛选时可以用于评价表达出的蛋白与原研药物的电荷分布情况是否一致。
在稳定性分析时用于观察是否发生电荷异构体组成成分的变化,以辅助分析及判断是否发生活性及安全性的变化。


案例展示

如下图所示,CEX pH梯度法能准确分离出上市单抗利妥昔的酸性变异体含量13.16%,主成分含量60.56%,碱性变异体含量26.271%,与文献报道一致,为抗体蛋白电荷变异体分析提供精准的数据支持。



服务内容

检测内容 检测方法 客户提供 交付物及标准 周期
电荷异质性  CEX-HPLC
待测抗体、缓冲液
检测报告
3 天

注:样品需透明澄清,无沉淀,浓度需大于1 mg/mL,总量不低于100 μg。

子服务5:电荷异质性和等电点分析(iCIEF)

技术简介

毛细管等电聚焦电泳是在毛细管两端加上直流电压,管内的载体两性电解质可以形成一定范围的pH梯度,蛋白质依据其所带电荷向阳极或阴极移动,直到净电荷为0的某个pH值(即等电点pI)时停止,最终蛋白质聚焦成很窄的区段,从而达到分离的目的,通常用于重组蛋白电荷异构体的指纹图分析。与传统的平板凝胶等电聚焦电泳相比,毛细管等电聚焦电泳(cIEF)具有更高的分离度、分析速度,定量能力和自动化性能。
    
dafabe888手机版登录提供的最新技术全柱成像毛细管等电聚焦法(iCIEF)可以对整个聚焦分离通道聚焦过程进行实时监控和记录,这一过程中无须移动样品,直接进行检测。该方法提高了电荷异质性分析的准确性和重复性,通常能在几分钟内完成测定,可实现高通量检测。iCIEF尤其在高度糖基化等复杂样品电荷异质性分析的准确性、重复性和分辨率较平板胶等电聚焦(IEF)及毛细管等电点聚焦(cIEF)具有明显的优势,更有利于重组生物技术药物的质量控制和稳定性研究。


应用方向

用于单抗、双抗、纳米抗体等多种蛋白质等电点pI鉴定。
和CEX用途一样,互为补充。


案例展示

如下图所示,iCIEF能够准确检测出上市抗体药物曲妥珠的pI值为8.97,与上市抗体药提供的pI值一致,表明此方法稳定可靠,为抗体蛋白pI值分析提供准确的数据支持。



服务内容

检测内容 检测方法 客户提供 交付物及标准 周期
等电点分析  iCIEF
待测抗体、缓冲液
检测报告
1 天

注:样品需透明澄清,无沉淀,浓度需大于1.0 mg/mL,总量不低于50 μg。

子服务6:高分辨分子量检测(LC-MS/MS)

技术简介

在生物制药领域,蛋白质药物分子量的测定是监控产品质量属性的关键步骤,从生物药早期的开发一直到生产阶段的QC放行,快速、准确的测定蛋白质药物的分子量就显得至关重要。对于生物大分子分析,飞行时间质谱的优势在于质荷比范围宽,理论上没有上限,除此之外能提供高分辨率以及非常宽的动态范围,因此飞行时间高分辨质谱是生物药分析的不二之选。


应用方向

测定蛋白药物精确分子量,可测完整、切糖、还原分子量。
提供理论序列可精确匹配其修饰情况。


案例展示

如下图所示,可获得蛋白多肽类药物A的精确分子量。



服务内容

检测内容 检测方法 客户提供 交付物及标准 周期
高分辨分子量检测  LC-MS/MS
待测抗体、缓冲液
检测报告
2 周

注:需提供理论分子量范围。供试品蛋白质量应不少于50 μg。

子服务7:肽谱分析(LC-MS/MS)

技术简介

肽谱分析是一种信息量非常丰富的蛋白质鉴定测试方法,尤其适用于重组方式生成的蛋白。分析中常需通过酶解(常使用胰蛋白酶)蛋白质生成肽段碎片,然后进行可重现的碎片分离和鉴定,从而检测并监测单一氨基酸变化、氧化、脱氨基及其他的降解产物。


应用方向

确证蛋白多肽的理论序列与修饰情况。常见修饰为脱酰胺、氧化等,抗体类常见修饰为脱酰胺、氧化、N端环化、C端赖氨酸缺失、N端糖基化。
鉴定二硫键定位情况。


案例展示

1. 肽段覆盖率

如Fig. 9 所示, 该蛋白样品的单酶切肽谱覆盖率已达98.4%,3种酶切肽谱进行重叠分析,肽谱覆盖率可达100%,可以很理想的准确确证蛋白的氨基酸序列。


Fig. 9 肽段覆盖率



2. 翻译后修饰

如下表所示,可获得脱酰胺修饰、氧化修饰肽段的序列、位点、比例等信息列表。




3. 二硫键定位

如下方数据所示,该样品分子内部的二硫键理论配对方式为 C53/C164、C181/C188。


Fig. 10 二硫键定位


服务内容

检测内容 检测方法 客户提供 交付物及标准 周期
肽段覆盖率 LC-MS/MS 待测抗体、缓冲液 检测报告 2 周
翻译后修饰 LC-MS/MS 待测抗体、缓冲液 检测报告 2 周
二硫键定位 LC-MS/MS 待测抗体、缓冲液 检测报告 2 周

注:供试品蛋白质量应不少于500 μg。液体样品需透明澄清,无沉淀;固体样品需干燥。


子服务8:肽图一致性分析(RP-UPLC)

技术简介

采用超高效液相色谱法对酶解后(常用胰蛋白酶)肽图谱进行分析,比较蛋白间肽图相似程度,可以确定蛋白的结构是否结构正确、是否出现降解、化学修饰等,保证生产批间一致性。


应用方向

在日常放行及稳定性分析时用于观察待检样品与理化对照品的对比图谱,以辅助分析及判断是否蛋白是否发生降解和结构的变化。


案例展示

如下图所示,可以观察到3个批次的样品一致性较好。



服务内容

检测内容 检测方法 客户提供 交付物及标准 周期
肽图一致性分析  RP-UPLC
待测抗体、缓冲液
检测报告
2 周

注:样品需透明澄清,无沉淀,浓度需大于5 mg/mL,总量不低于1 mg。

子服务9:N糖谱分析(HPLC / FLD)

技术简介

目前存在的蛋白质类药物中90%以上是糖蛋白,例如单克隆抗体。这些糖蛋白药物中含有复杂的寡糖基团,它们的存在与否和分布类型能显著影响生物药物的疗效、药代动力学特性、免疫原性、折叠方式以及稳定性。已经知道某些糖基结构可以导致药物分子聚集从而降低药物的疗效。糖基化的程度和类型与用于抗体生产的表达系统和细胞培养条件密切相关。因此,在整个发酵、纯化和制剂过程中,需要监测蛋白生物制剂中包含的N 连接糖基化结构的类型和相对数量,以确保药物产品的一致和稳定。

蛋白质上糖链的分析一般方法是通过酶解去糖基化和衍生化的方法。该方法使用N- 糖苷酶F (PNGase F),一种酰化酶,将糖蛋白中与天冬酰胺连接 (N-linked) 的寡糖链的剪切游离出来,随后剪切的糖链衍生化(2- 氨基苯甲酰,2-AB)标记。经衍生化的寡糖可采用液相色谱 / 荧光检 (HPLC / FLD)、液相色谱-质谱等多种方法分离和鉴定。液相色谱法经常使用亲水作用 (HILIC) 色谱柱分离糖链。


应用方向

N糖谱用于单克隆抗体的糖型结构分析,可鉴定糖型种类和相对数量。


案例展示

抗体药物A糖型图谱如Fig. 12所示,糖型种类和相对数量清晰,与文献报道的糖谱一致,表明此方法稳定可靠,可用于产品一致性和稳定性评价。


Fig. 12 荧光检测器(HPLC / FLD)检测的N糖图谱


服务内容

检测内容 检测方法 客户提供 交付物及标准 周期
N糖谱分析  HPLC / FLD 待测抗体、缓冲液
检测报告
2 周

注:供试品蛋白质量应不少于1 mg。液体样品需透明澄清,无沉淀;固体样品需干燥。

子服务10:唾液酸分析(UPLC-FLD)

技术简介

唾液酸是一种带负电荷的单糖,存在于多糖的非还原性末端。自然界中存在着各种各样的唾液酸,但生物药中存在于N-糖基和O-糖基上的两种主要唾液酸是N-乙酰基神经氨酸(Neu5Ac, 或NANA)和N-糖基神经氨酸(Neu5Gc,或NAGA)。人类无法合成Neu5Gc,它在药物上的存在可能导致免疫反应,如慢性炎症。抗Neu5Gc的抗体已在正常人血清中检测到,可中和任何包含生物药物在内的Neu5Gc,从而降低药物的疗效。细胞系的选择可以极大地影响生物药中唾液酸的类型,例如,大部分小鼠IgG上的唾液酸通常都是Neu5Gc。因此,为了药物的安全性和有效性,必须在产品生命周期的所有阶段监测唾液酸的水平和类型,并对批次之间的一致性进行质量控制。


应用方向

工业生产中抗体药物质量控制及批次间一致性监测。


案例展示

如下图所示该方法可以准确的检测出上市单抗阿达木中唾液酸(Neu5Ac,NANA)类型和含量,保留时间与阳性对照一致,表明此方法稳定可靠。



服务内容

检测内容 检测方法 客户提供 交付物及标准 周期
唾液酸分析  UPLC-FLD 待测抗体、缓冲液
检测报告
2 周

注:样品需透明澄清,无沉淀,浓度需大于1 mg/mL,总量不低于200 μg。

子服务11:热稳定性分析(DSF)

技术简介

抗体与荧光染料如SYPRO Orange混合,当该染料与疏水区域结合时会产生荧光。将混合物置于一定范围的温度下,如从25°C到95°C,温度变化速度为每两分钟1°C。随着温度升高,蛋白结构域打开,埋藏在内部的疏水残基开始暴露,和荧光染料结合,荧光强度将急遽增强。当荧光强度增加达到峰值时的温度即为其Tm值。


应用方向

早期筛选分子;
成药性评价;
制剂开发。


案例展示

如Fig. 14,Fig. 15所示,DSF能够准确检测出已上市抗体药物A的Tm1值为69.3℃,Tm2值为81.6℃,该组温度与文献报道的Tm值一致,表明此方法稳定可靠。


Fig. 14 药物A的荧光曲线


Fig. 15 药物A的一阶导数曲线



服务内容

检测内容 检测方法 客户提供 交付物及标准 周期
热稳定性  DSF 待测抗体、缓冲液
检测报告
2 天

注:SDS-PAGE还原纯度不小于95%,SEC纯度不小于95%。样品浓度需大于0.2 mg/mL,总量不低于20 μg。