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技术背景
抗体药物的生物学活性检测贯穿了药物研发的整个生命周期,从早期靶点的发现、抗体的筛选,再过渡至CMC阶段进行生产、临床应用,到最后上市,都会涉及生物活性的分析。在发现阶段,一旦确定抗体药物的分子形式并在哺乳动物细胞中表达出抗体蛋白分子后,就需要对抗体的生物活性进行验证与测定。活性测定是确保抗体类药物有效性的重要质控指标。抗体主要分为两个部分,Fab端和Fc端,活性检测相关的两个核心区域。Fab端含抗体的可变区,与抗体药物与靶点的结合以及功能的活性相关。Fc端可以和Fc受体蛋白以及补体相结合,与抗体的免疫学特性相关。

dafabe888手机版登录建立了成熟的多维生化表征分析平台,可基于ELISA、BLI等技术开发了包括各种生物活性、亲和动力学等生物学分析方法,在蛋白生化表征方面积累了大量经验,可提供快速、多维度和高质量的生化分析服务,帮助您在大量先导分子中快速筛选出较为优异的分子,快速实现“先导分子聚焦”,项目进展先人一步。同时提供严格的多层次的抗体药物杂质检测,对中试产品做好严格的QC质控,为您的抗体药保驾护航。


服务亮点
  • 多方位抗体蛋白水平功能评价
    1. 可对药物早期研发过程中产生的数十甚至上百个分子进行抗原结合活性、物种交叉活性、抗体阻断活性、抗体竞争能力、抗体与抗原结合表位分群等多方位功能检测,快速实现先导分子聚集。
  • 多种类蛋白互作检测
    1. 可对多种抗体形式(单抗,双抗全长抗体,Fab片段,细胞培养上清)进行抗体与抗原、Fcγ受体、FcRn以及C1q的亲和动力学以及抗原表位分群检测。经验丰富,已成功完成数百个项目的交付。
  • 多样化蛋白标记服务
    1. 提供专业的蛋白生物素标记服务,此外还可以提供HRP、FITC、PE等荧光标记服务。
  • 多层次蛋白杂质检测
    1. 提供宿主DNA残留检测、宿主蛋白残留检测、Protein A残留检测,全方位监控抗体药物的质量,为抗体药物的安全保驾护航。

附加服务
子服务1:蛋白水平功能评价(ELISA)

技术简介

酶联免疫吸附技术(ELISA)具有周期短、重复性高、通量大、成本低等特性,利用抗原-抗体特异性结合特性,可以对抗体药物早期研发过程中产生的数十甚至上百个先导抗体分子进行快速筛查,进而筛选与抗原结合能力较为优异的抗体分子。基于ELISA技术,dafabe888手机版登录已经开发出了抗原结合活性、物种交叉活性、抗体阻断活性、抗体竞争能力、抗体与抗原结合表位分群等多个检测方法,可快速实现先导分子的聚集。


dafabe888手机版登录不仅提供全长抗体的结合活性检测,还可对抗体产生阶段的Fab水平提前完成亲和检测,从而筛选出最优的一批抗体进行全长构建,保证分子功能的同时降低研发成本。


案例展示

1.1全长抗体与抗原结合活性

基于ELISA技术,可对Fab水平抗体以及全长抗体进行活性检测,以筛选结合活性较好的抗体进行后续功能研究。下图展示了采用ELISA技术分析Fab裂解液与抗原结合活性的一个案例:7号裂解液的亲和力优于对照抗体裂解液7%,11号裂解液与抗原不结合,可选择7号裂解液进行全长构建;


下图展示了采用ELISA技术分析全长抗体与抗原结合活性的一个案例:先导抗体1与抗原的结合活性相比于对照抗体提高了54.97%,先导抗体2无活性,可筛选先导抗体1作后续功能研究。



服务内容

检测内容 检测方法 客户提供 交付物及标准 周期
抗原结合活性检测  ELISA 亲和
抗原、对照抗体、供试抗体 
(或供试Fab裂解液)
检测报告
4 天


案例展示

1.2 抗体阻断能力检测

在人体中,细胞与细胞之间的相互沟通除直接接触外,更主要的是通过内分泌、旁分泌和自分泌一些信息分子来进行协调。当受到外界刺激时,这些信息分子的动态平衡被打破,从而诱发机体产生各种疾病。有效开发出对应的抗体药物,阻断该疾病产生的信号通路,已成为当前疾病治疗的关键。


dafabe888手机版登录可对抗体药早期研发过程中的Fab裂解液及全长抗体进行快速有效的阻断功能评价,从而筛选具有阻断能力抗体药物。


基于ELISA 技术,可对Fab水平抗体以及全长抗体进行阻断功能评价。


左图展示了采用ELISA技术分析Fab裂解液阻断受配体结合能力的一个案例:7号裂解液的阻断能力弱于对照抗体裂解液32.4%,11号裂解液的阻断能力弱于对照裂解液96.5%,可选择7号裂解液进行全长构建;


右图展示了采用ELISA技术分析全长抗体阻断受配体结合能力的一个案例:先导抗体与对照抗体的阻断能力相当,先导抗体2无阻断能力,从而可以选择先导抗体1进行功能研究。



服务内容

检测内容 检测方法 客户提供 交付物及标准 周期
抗体阻断能力检测  ELISA 阻断 
配体、受体、生物素标记受体、
供试全长抗体(或供试Fab裂解液)
检测报告
7 天


案例展示

1.3 抗体竞争能力检测

除亲和与阻断方法外,基于ELISA的竞争实验也是评价抗体药物功能的重要指标之一,其意义在于新生产抗体与市面已有抗体药物竞争结合相同抗原的活性中心,从而明确先导抗体与对照抗体结合的表位差异,评价该抗体的生物学功能。


dafabe888手机版登录可对抗体药早期研发过程中的Fab裂解液及全长抗体进行快速有效的竞争功能评价,从而筛选具有与配体/受体或对照抗体竞争能力的抗体药物。


基于ELISA技术,通过对Fab水平抗体以及全长抗体与阳性抗体进行竞争检测,可筛选出与阳性抗体具有相同结合表位的抗体。


左图展示了采用ELISA技术分析Fab裂解液与对照抗体裂解液竞争结合抗原的一个案例:A2号裂解液与对照抗体裂解液具有竞争能力,结合抗原的相同表位,H1号裂解液与对照抗体裂解液无竞争效果,结合抗原的不同表位,可选择A2号裂解液进行全长构建;


右图展示了采用ELISA技术分析全长抗体与对照抗体竞争结合抗原能力的一个案例:先导抗体1与对照抗体具有竞争能力,结合抗原的相同表位,先导抗体3与对照抗体的竞争能力很弱,可选择先导抗1进行后续功能研究。



服务内容

检测内容 检测方法 客户提供 交付物及标准 周期
抗体竞争能力检测  ELISA 竞争 
抗原、对照抗体、生物素标记对照抗体、
供试全长抗体(或供试Fab裂解液)
检测报告
7 天


案例展示

1.4 抗体结合表位分群

基于ELISA技术,采用竞争法或者双抗夹心法,可对抗体药研发早期生产的数十个抗体进行结合表位分组,可通过研究同组中其中一个抗体的生物学功能来评价,从而节约抗体药物早期研发成本。


基于ELISA竞争及双抗夹心技术,通过对全长抗体与阳性抗体进行检测,可以筛选结合表位相同,具有相同生物学功能的先导抗体。


下图展示了采用ELISA双抗夹心法(左图)和竞争法(右图)对先导抗体进行结合表位分群一个案例:先导抗体1和先导抗体3结合抗原的不同表位,而先导抗体2和先导抗体3结合抗原的相同表位,因而先导分子2和先导分子3具有相同的生物学功能。



服务内容

检测内容 检测方法 客户提供 交付物及标准 周期
抗体结合表位分群  ELISA 竞争
ELISA双抗夹心 
抗原、对照抗体、生物素标
记对照抗体、供试全长抗体 
检测报告 
7 天


案例展示

1.5 种属交叉活性检测

动物实验是抗体药临床前研究的主要阶段之一,利用ELISA技术,可在抗体药物进入动物实验前期,先与人、鼠、猴源抗原进行交叉活性检测,从而评价该抗体药物能否在人、鼠、猴体内发挥药效,进而为后期动物实验筛选合格的抗体。


基于ELISA亲和技术,可以对候选抗体与人、鼠、猴抗原的结合能力进行评估。


下图展示了抗体与人、鼠、猴源抗原交叉活性的一个案例。由图可知,对照抗体只有人猴交叉,而先导分子1同时具有人鼠猴交叉,从而可以在小鼠和猴子水平进行功能评估。



服务内容

检测内容 检测方法 客户提供 交付物及标准 周期
种属交叉活性检测  ELISA 亲和 
人/鼠/猴抗原、对照抗体、
供试抗体 
检测报告 
4 天
子服务2:亲和动力学检测(BLI)

生物膜层干涉技术(Biolayer interferometry,BLI)是基于光干涉原理的非标记技术。具有操作简单、检测时间短、样品耗量少、无需人工标签可直接参与分析、检测等优点。通过对光干涉信号的实时监测,BLI技术能够广泛应用于生物分子相互作用的分析和快速检测。


dafabe888手机版登录的亲和动力学检测服务可对多种抗体形式(单抗,双抗全长抗体,Fab片段,细胞培养上清)进行抗体与抗原、Fcγ受体、FcRn以及C1q的亲和动力学以及抗原表位分群检测。经验丰富,已成功完成数百个项目的交付。


抗体药物结合活性

治疗性抗体的功效取决于其Fab片段与靶点抗原的结合活性以及其Fc片段与Fc受体的相互作用。Fc片段通过和Fc受体以及补体C1q的结合实现在细胞体内的药代和药毒。体外检测抗体Fc与Fc受体的结合能够预测抗体药物功能效价。在早期药物发现中,作为潜在的抗体药物,Fc受体的亲和力能够作为药物功效及半衰期的预测指标,而在后期开发及大规模生产中,Fc受体的亲和力检测能够有效的质控(QC)。


案例展示

1.1 抗原结合活性

利用BLI技术,可以分析候选抗体与抗原的结合能力,进而评价其成药性。


下图展示了抗体与抗原结合活性分析的案例。由图可知, 抗体1(Ab 1)与抗原的亲和力要比抗体2(Ab 2)高一个数量级。




服务内容

Sample ID 检测方法 客户提供 交付物及标准 周期
抗原结合活性检测  ELISA 亲和
抗原、对照抗体、供试抗体 
(或供试Fab裂解液)
检测报告
4 天


1.2 抗体阻断能力检测

在人体中,细胞与细胞之间的相互沟通除直接接触外,更主要的是通过内分泌、旁分泌和自分泌一些信息分子来进行协调。当受到外界刺激时,这些信息分子的动态平衡被打破,从而诱发机体产生各种疾病。有效开发出对应的抗体药物,阻断该疾病产生的信号通路,已成为当前疾病治疗的关键。


dafabe888手机版登录可对抗体药早期研发过程中的Fab裂解液及全长抗体进行快速有效的阻断功能评价,从而筛选具有阻断能力抗体药物。


案例展示

基于ELISA 技术,可对Fab水平抗体以及全长抗体进行阻断功能评价。


左图展示了采用ELISA技术分析Fab裂解液阻断受配体结合能力的一个案例:7号裂解液的阻断能力弱于对照抗体裂解液32.4%,11号裂解液的阻断能力弱于对照裂解液96.5%,可选择7号裂解液进行全长构建;


下图展示了采用ELISA技术分析全长抗体阻断受配体结合能力的一个案例:先导抗体与对照抗体的阻断能力相当,先导抗体2无阻断能力,从而可以选择先导抗体1进行功能研究。




Sample ID  KD(M) Kon(1/Ms)  Kid(1/s) Full R^2
Ab 1  3.11x10-10 
2.16x105
6.71x10-5
0.99
Ab 2 2.42x10-9 1.15x105 2.78x10-4 0.99


案例展示

2.1 抗体与Fc受体蛋白的结合活性

利用BLI技术,可以分析候选抗体与Fc受体蛋白的结合能力,进而评价其药效和半衰期。


Fig. 7展示了抗体与Fcγ受体结合活性测定的案例。由图可知,该抗体抗体与Fcγ受体的亲和常数为2.28 μM。


Fig. 7 抗体与Fcγ受体结合(BLI)


Fig. 8展示了抗体与FcRn受体结合活性测定的案例。由图可知,该抗体与FcRn结合的亲和常数为0.14 μM,由此可预测抗体药物的半衰期,从而筛选有较高亲和力的理想抗体 。


Fig. 8 抗体与FcRn结合(BLI)


服务内容

检测内容 检测方法 客户提供 交付物及标准  周期
抗体与抗原结合活性检测  BLI 
抗原、对照抗体、生物素标记对照抗体、
供试全长抗体(或供试Fab裂解液)
检测报告
4 天
抗体与Fc受体蛋白结合活性 
检测
BLI Fc受体蛋白、对照抗体、供试全长抗体
检测报告 4 天
抗体和C1q结合活性检测 BLI
C1q、对照抗体、供试全长抗体 检测报告 4 天


案例展示

2.2 多种抗体形式检测

dafabe888手机版登录的亲和动力学检测服务可对多种抗体形式(单抗,双抗全长抗体,Fab片段,细胞培养上清)进行抗体与抗原的亲和动力学以及抗原表位分群检测。


下图展示的是Fab裂解液与抗原的解离速度排序案例,由图可知,Fab裂解液1与抗原结合的解离速度要比Fab裂解液2快一个数量级,因此,Fab裂解液2与抗原具有较高的亲和力,可以选其进行后续抗体全长构建及功能分析。



Sample ID  KD(M) Kon(1/Ms)  koff(1/s) R2
Fab lysate 1  2.19x10-10 
1.94x106
4.25x10-4
0.967
Fab lysate 2
8.37x10-11
8.21x105
6.87x10-5
0.996


服务内容

检测内容 检测方法 客户提供 交付物及标准 周期
Fab裂解液解离速度排序  BLI 
抗原、对照抗体、供试Fab裂解液 
检测报告 
7 天
子服务3:蛋白标记服务

蛋白标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到蛋白上的技术。这些标记物的增强放大效应可显示免疫反应系统中抗原或抗体的性质与含量,己被广泛用于医学病理学、免疫组织化学、分子生物学、生物制药等领域的分析研究与技术测定。


dafabe888手机版登录拥有国内领先的抗体服务技术、先进的仪器设备和专业的抗体技术人员,可为客户提供包括生物素标记、荧光素标记、酶标记等一流的蛋白标记技术服务。


案例展示

将蛋白标记生物素,可将其作为工具抗体,进行阻断、竞争等体外功能评价。


下图展示了对一个抗体进行生物素标记的案例。由左图残留检测结果可知,标记后抗体无游离生物素残留;由中图标记效果可知,蛋白已成功标记生物素,由右图活性检测结果可知,标记后抗体EC50值由0.031 μg/mL变为0.049 μg/mL,基本不影响蛋白活性。



服务内容

检测内容 检测方法 客户提供 交付物及标准 周期
蛋白生物素标记  ELISA
待标记蛋白、生物素标记个数、
蛋白分子量
检测报告
4 天
蛋白FITC标记 ELISA 待标记蛋白、标记质量、
蛋白分子量
检测报告 4 天
蛋白PE标记 ELISA
待标记蛋白、量、
蛋白分子量
检测报告 4 天
子服务4:杂质残留检测

杂质分析是抗体药物质量管理体系的重要的环,根据杂质来源不同,又可分为工艺相关杂质(process related impurities)及产品相关杂质(product related impurities)对于不同的杂质,需依照其自身的理化性质或生物活性来选择合适的检测方法,残留量限度也应根据其对药物的安全性、有效性的影响进行规定。杂质的检测分析贯穿药物研发始终,是保障药物质量与安全的重要因素。

dafabe888手机版登录建立了成熟的工艺相关杂质检测平台,可提供宿主细胞DNA残留(host cell DNA,HCD)、宿主细胞蛋白残留(host cell proteins,HCP)和Protein A残留检测,为抗体药物生产过程控制和终产品的质量控制提供科学依据。


案例展示

4.1 CHO细胞DNA残留检测

在重组蛋白类药物生产中,残余DNA作为细胞基质中潜在的危险因素,一直是人们关注的重点。残余DNA本身作为外源物质,可以引起机体的免疫反应,甚至可能引起细胞癌变。各国药典陆续提供数种关于宿主细胞残留DNA检测经典的方法,目前以实时定量聚合酶链式反应(Q-PCR)方法为最优,因其专一性强、灵敦度高、快速且可实现高通量,荧光探针PCR是其中的一种。dafabe888手机版登录采用荧光探针PCR法检测CHO宿主DNA残留。


利用荧光探针PCR技术,可以对所产抗体药中的CHO宿主细胞DNA进行残留检测。


Fig. 11展示了对一个抗体药物进行宿主DNA残留检测的案例,结果显示,该抗体药CHO宿主DNA残留量为:5.9 pg/mg,提取回收率为83.53%,符合国家标准(每1支/瓶应不高于100pg(通则3407))。


Fig. 11 宿主DNA残留检测


服务内容

检测内容 检测方法 客户提供 交付物及标准 周期
CHO细胞DNA残留检测  荧光探针PCR 
供试蛋白
检测报告
7 天


案例展示

4.2 宿主细胞蛋白残留检测

宿主细胞蛋白(Host Cell Protein, HCP)是指生物制品中来自生产细胞系的宿主细胞的蛋白成分,主要包括宿主细胞分泌的蛋白以及细胞凋亡、代谢产生的部分结构蛋白。作为生物制品生产过程中的残留杂质,HCP具有潜在的安全风险,包括诱导免疫应答。残余HCP的监控,不仅对生产纯化工艺的检验具有重要意义,同时也是药物安全性的重要保障。在监测HCP方面,当前应用最广泛的方法依然是ELISA法。该方法操作简单,灵敏度高,方便建立控制范围和制定操作规范。


基于ELISA技术,采用宿主细胞蛋白残留检测试剂盒,可对抗体药中的宿主细胞蛋白残留量进行检测。


Fig. 12展示了抗体药物进行宿主蛋白残留检测的一个案例,结果显示,该抗体药宿主蛋白残留量为:5.31 ng/mg,加标回收率为90.18%,符合国家标准(用ELISA法(通则3429)测定,应不高于蛋白质总量的0.01%)。


Fig. 12 宿主蛋白残留检测


服务内容

检测内容 检测方法 客户提供 交付物及标准 周期
宿主细胞蛋白残留  ELISA 
供试蛋白
检测报告
7 天


案例展示

4.3 Protein A残留检测

Protein A因其可与免疫球蛋白高亲和力结合而被广泛用于Fc融合蛋白或抗体类药物的纯化工艺中。但正是由于Protein A与药物蛋白的结合力较强,在洗脱过程中需要使用较高强度的洗脱液使蛋白脱离,在这种洗脱环境下,经常会造成Protein A介质浸出。浸出的Protein A作为外源蛋白,可能会诱导免疫应答。ELISA法是检测Protein A残留的首选。


基于ELISA技术,采用蛋白质A残留检测试剂盒,可对抗体药中的蛋白质A残留量进行检测。


Fig. 13展示了对一个抗体药物进行Protein A残留检测的案例,结果显示,该抗体药Protein A残留量为: 0.0001%,符合药典标准(用ELISA法(通则3429)测定,Protein A残留量应不高于蛋白质总量的0.001%)。


Fig. 13 Protein A残留检测


服务内容

检测内容 检测方法 客户提供 交付物及标准 周期
Protein A残留检测  ELISA 
供试蛋白
检测报告
7 天