1. 原代细胞分离

如图Fig. 3所示，PBMC经分离纯化得到CD4+T、CD3+T、单核细胞等不同类型原代细胞，分选后的细胞纯度通常可达95%，甚至更高，为下一步的药效筛选提供充分保障。

Fig. 3 人原代细胞分离

2. 肿瘤特异性抗原（TSA）

2.1 内吞活性测定

内吞是指细胞表面蛋白内化的过程。抗体介导的内吞测定是开发ADC药物的一种关键体外活性试验，内吞检测方法有多种，如pH敏感的检测方法、FACS检测法、Fab-Zap毒素杀伤法等，多种方法dafabet黄金手机版均可提供服务。Fab-Zap是一种小分子抑制剂，通过抗体介导的内吞作用进入细胞，抑制细胞生长。如图Fig. 4所示，靶细胞经对照抗体处理后，通过LDH法检测，发现细胞生长受到明显抑制，表明该对照抗体具有良好的内吞活性。（更多内吞检测方法请与dafabe888手机版登录联系）

Fig. 4 内吞活性测定

2.2 ADCC测定

ADCC(Antibody dependent cytotoxicity)是一种抗体依赖的细胞杀伤作用，一般为自然杀伤细胞（Nature killer cell, NK）介导。抗体Fab端结合靶细胞表面抗原，Fc端结合NK细胞表面的Fc受体CD16，将靶细胞与NK细胞拉近距离，并激活NK细胞释放颗粒酶和穿孔素等，最终导致靶细胞被裂解。SK-BR-3是一种乳腺癌细胞系，表达her2。针对her2的T药有很强的ADCC效应。在该ADCC实验中，效应细胞为PBMC细胞，靶细胞是SK-BR-3细胞。如图Fig. 5所示，通过LDH法测得，在T药物的作用下细胞裂解率显著增加，表明T药物介导产生了很强的靶细胞杀伤效应。

Fig. 5 ADCC测定

2.3 CDC测定

CDC(Complement dependent cytotoxicity)是补体介导的细胞毒作用，补体与抗体/靶蛋白组成复合物，介导细胞的杀伤效应。抗体可以有效诱导补体依赖的杀伤效应，对细胞造成强烈的杀伤。如图Fig. 6 所示，靶细胞经候选抗体（Candidate1）处理后，细胞裂解率显著增加，表明该候选抗体可以诱导强烈的CDC效应，导致细胞大量死亡。

Fig. 6 CDC测定

2.4 吞噬实验

吞噬作用（Phagocytosis）是指巨噬细胞利用胞吞作用对靶细胞进行吞噬和杀伤的过程。在吞噬实验中，通过抗体阻断“别吃我”信号，可以促进巨噬细胞对靶细胞的吞噬。如图Fig. 7所示，通过FACS检测发现，经候选抗体（Candidate1）处理，巨噬细胞对靶细胞的吞噬作用显著增强，表明该候选抗体对“别吃我”信号通路有很好的阻断活性。

Fig. 7 吞噬实验

2.5 增殖抑制实验

许多细胞因子具有促进或抑制细胞生长的作用，即增值抑制效果。增殖抑制实验中，IL-4会促进TF-1细胞增殖，中和IL-4可以抑制IL-4介导的细胞增殖。如图Fig. 8所示，在Benchmark（anti-IL-4）作用下发光强度显著降低，表明TF-1细胞的增殖受到有效抑制, Benchmark（anti-IL-4）可以有效中和IL-4。

Fig. 8 增殖抑制实验

3. 共刺激免疫检查点（CIC）

肿瘤坏死因子超家族蛋白成员如OX40、4-1BB、GITR等属于共刺激免疫检查点蛋白，配体或激动剂抗体结合后会促进信号通路激活，介导下游生物学效应。CD40与CD40L结合后会促进CD95的表达，加剧细胞凋亡。如图Fig. 9所示，CD40候选抗体A1-A7均可显著降低CD95的表达，表明这些候选抗体很好的阻断了CD40与CD40L的结合，具有很好的生物活性。

Fig. 9 表达抑制实验

4. 抑制型免疫检查点（IIC）

4.1 MLR实验

混合淋巴细胞反应（Mixed lymphocyte reaction, MLR）是指两个不同供体的淋巴细胞混合培养的实验，实验一般用于免疫抑制检查点抗体的评价工作。本MLR实验，使用不同donor的CD4+T细胞及DC细胞共培养，抗PD-L1的抗体可有效打破PD1/PD-L1抑制信号，活化T细胞，促进细胞因子的分泌。如图Fig. 10所示，经candidate1处理后，细胞的IL-2与IFN-γ的分泌量均显著增加，表明其具有与已上市的3个抗体药物有高度相似的生物学活性。

Fig. 10B 异源MLR实验中IFN-γ的分泌检测

4.2 细胞水平的结合、阻断活性分析

Fig. 11A展示了采用FACS分析抗体与细胞表面蛋白结合活性的一个案例项目，Fig. 11B展示使用FACS分析抗体对受体配体结合的阻断活性的一个案例。由图可知，全部先导抗体分子均展现了优于对照抗体的结合活性和阻断活性。

Fig. 11A 结合活性分析（FACS）

Fig. 11B 阻断活性分析（FACS）

4.3 抗体表位分析

如图Fig. 12所示，Candidates1-5均可竞争性抑制Tar-get Ab与目标抗原的结合，表明这6个抗体识别同一表位。 

Fig. 12 竞争性结合测定（FACS）

4.4 TIGIT 荧光素酶报告系统

TIGIT是T细胞深度耗竭的表面标记物，阻断其与CD155的负调控信号通路可有效激活效应细胞。本报告基因细胞株体系效应细胞株以Jurkat细胞作为宿主细胞，过表达人TIGIT受体蛋白和NF-AT-LUC2反应原件；aAPC细胞株以CHO-S细胞为宿主细胞，表达αCD3 scFv抗体和CD155蛋白在细胞膜上。

如图Fig.13所示，在对照抗体Benchmark的处理下，细胞的荧光强度显著增强，表明对照抗体可以有效阻断CD155与TIGIT之间的相互作用，从而逆转TIGIT负调控信号，激活效应T细胞应答。

Fig. 13 TIGIT 荧光素酶报告系统

5. 其他免疫调节（OIM）

5.1 中和实验 

TGF-β能诱导肿瘤细胞表达特定细胞因子，中和TGF-β，减少相应细胞因子的分泌。如图Fig. 14所示，经候选抗体Candidate Ab（anti-TGF-β）处理，IL-11的分泌量显著降低，表明TGF-β得到了有效的中和，说明该候选抗体具有很好的生物活性。

Fig. 14 中和测定

5.2 TGF-β 荧光素酶报告系统

中和TGF-β可有效阻断下游的SMAD磷酸化信号通路。本报告基因细胞株体系采用HEK293细胞作为宿主细胞，过表达人TGF-βRII受体蛋白和SRE-Luc2反应原件，可用来评价候选抗体对TGF-β的中和作用。如图Fig.15所示，在对照抗体Benchmark的处理下，细胞的荧光强度显著降低，表明对照抗体可以有效中和TGF-β，从而降低TGF-β介导的SMAD磷酸化信号。

Fig. 15 TGF-β 荧光素酶报告系统

5.3 自免相关细胞因子中和实验

IL-33可诱导Th2细胞因子的产生，并与哮喘疾病的发生发展相关。 利用构建的荧光酶报告基因系统细胞株，将IL-33蛋白与梯度稀释的αIL-33抗体预先混合，后将效应细胞与上述混合液混合均匀，于CO2培养箱共孵育，培养18小时后检测荧光信号。如图Fig. 16所示，IL-33可诱导效应细胞产生信号， αIL-33抗体可有效中和IL-33，抑制该信号。

Fig. 16 αIL-33抗体中和IL-33因子信号通路

5.4 血管形成实验

某细胞因子具有促进血管形成的功能。本实验中，利用HUVEC细胞进行小管形成实验，将IgG1对照抗体和该细胞因子的阳性抗体分别预处理HUVEC细胞，将细胞铺板于matrigel上培养4-6小时，观察抗体对小管形成的影响。如图Fig. 17所示，IgG1抗体组小管形成正常，阳性对照组小管形成受到明显抑制，表明该阳性抗体可以有效中和该细胞因子。

Fig. 17 小管形成实验

5.5 中性粒细胞趋化实验

趋化因子可通过趋化因子受体有效诱导中性粒细胞产生趋化现象。如图Fig. 18所示，在加入该细胞因子的对照抗体Benchmark的处理下，该细胞因子诱导的中性粒细胞的趋化作用显著降低，表明对照抗体可以有效中和该细胞因子，从而降低其介导的趋化作用。

Fig. 18 中性粒细胞趋化实验