菜单
技术背景
2011年,首个免疫检查点抑制剂免疫检查点抑制剂(Yervo)的上市,标志着肿瘤免疫时代的到来。近年来,随着多个PD-1/PD-L1抑制剂的上市,以免疫检查点抑制剂为代表的抗体药物已成为创新药物研发的热点,免疫治疗时代2.0已经开启。在以免疫检查点为主流的创新抗体药物研发过程中,抗体的体外药效评价环节是重中之重,解决这一问题即可大幅加快抗体药物的发现、筛选、优化的进程。 

在创新靶点层出不穷的创新时代,在以免疫检查点为主流的创新抗体药物研发对体外筛选提出了严峻的挑战,满足稳定的高通量筛选与模拟体内机制的个性化模型的结合是体外药效筛选的趋势。dafabe888手机版登录聚焦创新抗体药物研发,耗时近5年建立了稳定、高效、可靠的体外药效筛选评价平台。

平台包括数十种药效评价体系、上百种靶点的肿瘤细胞系、种类齐全的人/鼠原代细胞。丰富的模型储备,先人一步,节省您宝贵时间。团队成员拥有数十个项目的评价经验,可在短期内针对任一靶点快速建立适合的评价体系,完成复杂的模型构建工作,帮助客户进行多维度的体外药效评价。

服务亮点
  • 完善的体外评价体系
    1. 上百种靶点的过表达细胞系,数十种人工报告基因体系,高精密仪器,全流程设计,可满足不同需求。
  • 多样化的靶点选择
    1. 可针对任一肿瘤治疗药物靶点、不同药物作用机制进行评价,不惧难度。
  • 丰富的原代细胞模型
    1. 种类齐全的人/ 鼠原代细胞,在体外真实还原完整生物过程。
  • 高成功率个性化开发
    1. 可以根据客户需求,个性化研发所需的多维药效评价体系。

案例展示

1. 原代细胞分离

如图Fig. 3所示,PBMC经分离纯化得到CD4+T、CD3+T、单核细胞等不同类型原代细胞,分选后的细胞纯度通常可达95%,甚至更高,为下一步的药效筛选提供充分保障。


Fig. 3 人原代细胞分离


2. 肿瘤特异性抗原(TSA)

2.1 内吞活性测定

内吞是指细胞表面蛋白内化的过程。抗体介导的内吞测定是开发ADC药物的一种关键体外活性试验,内吞检测方法有多种,如pH敏感的检测方法、FACS检测法、Fab-Zap毒素杀伤法等,多种方法dafabet黄金手机版均可提供服务。Fab-Zap是一种小分子抑制剂,通过抗体介导的内吞作用进入细胞,抑制细胞生长。如图Fig. 4所示,靶细胞经对照抗体处理后,通过LDH法检测,发现细胞生长受到明显抑制,表明该对照抗体具有良好的内吞活性。(更多内吞检测方法请与dafabe888手机版登录联系)


Fig. 4 内吞活性测定


2.2 ADCC测定

ADCC(Antibody dependent cytotoxicity)是一种抗体依赖的细胞杀伤作用,一般为自然杀伤细胞(Nature killer cell, NK)介导。抗体Fab端结合靶细胞表面抗原,Fc端结合NK细胞表面的Fc受体CD16,将靶细胞与NK细胞拉近距离,并激活NK细胞释放颗粒酶和穿孔素等,最终导致靶细胞被裂解。SK-BR-3是一种乳腺癌细胞系,表达her2。针对her2的T药有很强的ADCC效应。在该ADCC实验中,效应细胞为PBMC细胞,靶细胞是SK-BR-3细胞。如图Fig. 5所示,通过LDH法测得,在T药物的作用下细胞裂解率显著增加,表明T药物介导产生了很强的靶细胞杀伤效应。


Fig. 5 ADCC测定


2.3 CDC测定

CDC(Complement dependent cytotoxicity)是补体介导的细胞毒作用,补体与抗体/靶蛋白组成复合物,介导细胞的杀伤效应。抗体可以有效诱导补体依赖的杀伤效应,对细胞造成强烈的杀伤。如图Fig. 6 所示,靶细胞经候选抗体(Candidate1)处理后,细胞裂解率显著增加,表明该候选抗体可以诱导强烈的CDC效应,导致细胞大量死亡。



Fig. 6 CDC测定


2.4 吞噬实验

吞噬作用(Phagocytosis)是指巨噬细胞利用胞吞作用对靶细胞进行吞噬和杀伤的过程。在吞噬实验中,通过抗体阻断“别吃我”信号,可以促进巨噬细胞对靶细胞的吞噬。如图Fig. 7所示,通过FACS检测发现,经候选抗体(Candidate1)处理,巨噬细胞对靶细胞的吞噬作用显著增强,表明该候选抗体对“别吃我”信号通路有很好的阻断活性。


Fig. 7 吞噬实验


2.5 增殖抑制实验

许多细胞因子具有促进或抑制细胞生长的作用,即增值抑制效果。增殖抑制实验中,IL-4会促进TF-1细胞增殖,中和IL-4可以抑制IL-4介导的细胞增殖。如图Fig. 8所示,在Benchmark(anti-IL-4)作用下发光强度显著降低,表明TF-1细胞的增殖受到有效抑制, Benchmark(anti-IL-4)可以有效中和IL-4。


Fig. 8 增殖抑制实验


3. 共刺激免疫检查点(CIC)

肿瘤坏死因子超家族蛋白成员如OX40、4-1BB、GITR等属于共刺激免疫检查点蛋白,配体或激动剂抗体结合后会促进信号通路激活,介导下游生物学效应。CD40与CD40L结合后会促进CD95的表达,加剧细胞凋亡。如图Fig. 9所示,CD40候选抗体A1-A7均可显著降低CD95的表达,表明这些候选抗体很好的阻断了CD40与CD40L的结合,具有很好的生物活性。


Fig. 9 表达抑制实验


4. 抑制型免疫检查点(IIC)

4.1 MLR实验

混合淋巴细胞反应(Mixed lymphocyte reaction, MLR)是指两个不同供体的淋巴细胞混合培养的实验,实验一般用于免疫抑制检查点抗体的评价工作。本MLR实验,使用不同donor的CD4+T细胞及DC细胞共培养,抗PD-L1的抗体可有效打破PD1/PD-L1抑制信号,活化T细胞,促进细胞因子的分泌。如图Fig. 10所示,经candidate1处理后,细胞的IL-2与IFN-γ的分泌量均显著增加,表明其具有与已上市的3个抗体药物有高度相似的生物学活性。


Fig. 10A 异源MLR实验中IL-2的分泌检测


Fig. 10B 异源MLR实验中IFN-γ的分泌检测


4.2 细胞水平的结合、阻断活性分析

Fig. 11A展示了采用FACS分析抗体与细胞表面蛋白结合活性的一个案例项目,Fig. 11B展示使用FACS分析抗体对受体配体结合的阻断活性的一个案例。由图可知,全部先导抗体分子均展现了优于对照抗体的结合活性和阻断活性。


Fig. 11A 结合活性分析(FACS)


Fig. 11B 阻断活性分析(FACS)


4.3 抗体表位分析

如图Fig. 12所示,Candidates1-5均可竞争性抑制Tar-get Ab与目标抗原的结合,表明这6个抗体识别同一表位。 


Fig. 12 竞争性结合测定(FACS)


4.4 TIGIT 荧光素酶报告系统

TIGIT是T细胞深度耗竭的表面标记物,阻断其与CD155的负调控信号通路可有效激活效应细胞。本报告基因细胞株体系效应细胞株以Jurkat细胞作为宿主细胞,过表达人TIGIT受体蛋白和NF-AT-LUC2反应原件;aAPC细胞株以CHO-S细胞为宿主细胞,表达αCD3 scFv抗体和CD155蛋白在细胞膜上。


如图Fig.13所示,在对照抗体Benchmark的处理下,细胞的荧光强度显著增强,表明对照抗体可以有效阻断CD155与TIGIT之间的相互作用,从而逆转TIGIT负调控信号,激活效应T细胞应答。


Fig. 13 TIGIT 荧光素酶报告系统


5. 其他免疫调节(OIM)

5.1 中和实验 

TGF-β能诱导肿瘤细胞表达特定细胞因子,中和TGF-β,减少相应细胞因子的分泌。如图Fig. 14所示,经候选抗体Candidate Ab(anti-TGF-β)处理,IL-11的分泌量显著降低,表明TGF-β得到了有效的中和,说明该候选抗体具有很好的生物活性。



Fig. 14 中和测定


5.2 TGF-β 荧光素酶报告系统

中和TGF-β可有效阻断下游的SMAD磷酸化信号通路。本报告基因细胞株体系采用HEK293细胞作为宿主细胞,过表达人TGF-βRII受体蛋白和SRE-Luc2反应原件,可用来评价候选抗体对TGF-β的中和作用。如图Fig.15所示,在对照抗体Benchmark的处理下,细胞的荧光强度显著降低,表明对照抗体可以有效中和TGF-β,从而降低TGF-β介导的SMAD磷酸化信号。


Fig. 15 TGF-β 荧光素酶报告系统


5.3 自免相关细胞因子中和实验

IL-33可诱导Th2细胞因子的产生,并与哮喘疾病的发生发展相关。 利用构建的荧光酶报告基因系统细胞株,将IL-33蛋白与梯度稀释的αIL-33抗体预先混合,后将效应细胞与上述混合液混合均匀,于CO2培养箱共孵育,培养18小时后检测荧光信号。如图Fig. 16所示,IL-33可诱导效应细胞产生信号, αIL-33抗体可有效中和IL-33,抑制该信号。


Fig. 16 αIL-33抗体中和IL-33因子信号通路


5.4 血管形成实验

某细胞因子具有促进血管形成的功能。本实验中,利用HUVEC细胞进行小管形成实验,将IgG1对照抗体和该细胞因子的阳性抗体分别预处理HUVEC细胞,将细胞铺板于matrigel上培养4-6小时,观察抗体对小管形成的影响。如图Fig. 17所示,IgG1抗体组小管形成正常,阳性对照组小管形成受到明显抑制,表明该阳性抗体可以有效中和该细胞因子。


Fig. 17 小管形成实验


5.5 中性粒细胞趋化实验

趋化因子可通过趋化因子受体有效诱导中性粒细胞产生趋化现象。如图Fig. 18所示,在加入该细胞因子的对照抗体Benchmark的处理下,该细胞因子诱导的中性粒细胞的趋化作用显著降低,表明对照抗体可以有效中和该细胞因子,从而降低其介导的趋化作用。

Fig. 18 中性粒细胞趋化实验